近日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所（岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心）徐炜团队开发了一项高通量、低成本R-loop定量图谱绘制技术“mDRIP-seq”，并应用该技术绘制了酿酒酵母突变株R-loop定量图谱。该研究成果以“mDRIP-seq is a high-throughput method for quantitative profiling of R-loop landscape”为题在线发表于《科学通报（Science Bulletin）》期刊。

R-loop是由一条DNA:RNA杂合链和一条DNA单链构成的三链染色质结构，广泛存在于各种生物基因组中，并参与诸如基因表达调控、DNA修复等重要生物学过程。全基因组水平R-loop图谱数据为R-loop的特征、生物学功能和相关调控因子的研究工作提供了重要的支持。然而，现有R-loop图谱绘制技术通量有限，限制了R-loop生物学研究在大规模群体样本中的展开。

为了建立高通量R-loop图谱绘制技术，研究团队通过开发单链条形码标记技术实现了样本基因组DNA精确标记，并在ssDRIP-seq技术[基础上，通过重构技术流程，最终开发出mDRIP-seq技术（图1a）。基因组中R-loop含量较低，对基因组DNA的高效率标记是建立该技术的关键。为此，团队开发了加尾单链连接技术，在保持核酸结构完整性的前提下，可将标签序列高效连接到双链DNA、杂合链中DNA及单链DNA的3’端（图1b）。通过将多个标记后的样本混合在一管中，进行同步的R-loop富集及文库构建操作，mDRIP-seq技术实现了R-loop测序的高通量化和低成本化。和原有技术相比，mDRIP-seq每个样本的文库构建时间降低至1/6（图1c），平均文库构建成本降低至1/7（图1d）。

图1 mDRIP-seq技术概况。（a）mDRIP-seq流程示意图；（b）加尾单链连接技术对杂合链DNA进行标记示意图；

（c）mDRIP-seq和ssDRIP-seq操作时长比较；（d）mDRIP-seq和ssDRIP-seq建库成本比较。

mDRIP-seq中的DRIP文库，反映了基因组中R-loop的水平，而Input文库反映了起始投入量的差异。利用这两个文库的数据，mDRIP-seq可以简化样本间的定量比较（图2a）。基于mDRIP-seq，研究团队对多个物种样本R-loop水平进行了定量评估和比较，并发现不同物种R-loop水平的差异一定程度上可以由基因密度的差异解释（图2b和2c）。进一步，研究团队利用该技术首次对近100种解旋酶活性和组蛋白修饰活性相关基因缺失的酿酒酵母突变株进行了R-loop定量图谱的绘制和分析，揭示了这些突变株中R-loop的变化模式（图2d）。其中，SNF2、SNF5、SNF6、DEF1或NAM7等基因的缺失，导致编码蛋白基因、逆转座子等基因组位点R-loop水平的降低，而缺失MED1、RAD51或RAD52等基因的突变株呈现R-loop水平上升的特征（图2d）。酵母突变株R-loop图谱集的绘制，为R-loop调控因子及调控机理的研究提供了重要的数据支持。

图2 mDRIP-seq技术的应用。（a）mDRIP-seq对HEK293T不同投入量gDNA的R-loop水平进行定量；（b）mDRIP-seq对不同物种样本R-loop

进行定量；（c）R-loop含量和基因密度的相关性；（d）酵母突变株R-loop变化热图。

该研究开发的mDRIP-seq技术，为R-loop全基因组水平研究提供了一种高效便捷的技术工具，并将推动R-loop研究工作在农业、医学等领域的进一步拓展。中国农业科学院深圳农业基因组研究所徐炜研究员为论文的通讯作者，基因组所博士后孙长斌为论文的第一作者，基因组所科研助理王珍珍、清华大学李沁博士及孙前文副教授为该工作提供了帮助。该研究得到了中国农业科学院青年创新专项、国家自然科学基金、中国博士后科学基金以及国家重点研发计划的支持。